生信下机数据基础知识(8)-Chipseq概述

R和SVG的较量 2020-07-27

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这一章和下一章节概述一下Chipseq相关的知识，例如：p53蛋白的DNA binding sitesequence，通过实验手段获取特定片段，随后通过分析获取p53特异结合的DNA sequence，那么如何获取的呢？怎么分析呢？

Chipseq概述

Chipseq全称是Chromatin Immunoprecipitation sequencing，其中Chip是实验手段-染色质免疫共沉淀，然后结合了测序技术进行测序（sequencing）。因此这个技术的重点是在Chip这个实验手段，那么这个实验手段的原理是什么？目的又是什么？

Chip的原理

真核生物基因表达的过程，也就是转录，会涉及到大量的蛋白质和DNA的相互作用，这些跟DNA相互作用的蛋白质也就是我们说的调控蛋白，或者转录因子（transcription factor|TF）【这里的蛋白质不包括与DNA异同构成核小体单元的组蛋白，组蛋白属于DNA的结构蛋白】。TF跟DNA相互作用，可以调控细胞的转录活动，决定了哪些基因高表达，哪些基因低表达，哪些基因不表达。换个方面来思考，虽然同一物种或者同一组织细胞均含有相同的DNA序列，但是外表看起来却不尽相同，表达的蛋白也并不完全相同，这个过程不仅仅是跟DNA本身的序列有差异，还跟转录的调控机制有很大关系，它涉及到不同表观修饰的影响，因此，通过更详细的了解DNA上的表观修饰以及不同TF跟DNA序列的相互作用，来了解转录调控的时间、空间上的机制，或许可以有助于我们更好的理解生命的奥秘[1]。

实际情况中，这个过程并不是单一的某个TF跟某一段DNA的相互作用，而是涉及到各种不同的TF的转录调控，因此就有了各种不同细胞类型，不同时期的不同的转录本的表达，以及相同组织细胞不同的转录表达，如下图，为了便于初学者了解，我们常看到的简易版TF-DNA结合，调控转录过程：

而实际上TF-DNA结合过程中，TF其实是很多个不同作用的调控蛋白复合物的一个集合，他们的调控转录过程要比简易版本的复杂的多，如下一个例子：

激活的TF跟DNA的特异序列（promoter|enhancer）相结合来启动和增强转录过程。因此，激活的转录因子是特异基因的表观调控子。DNA弯曲蛋白将激活激活物质带到启动子邻近区域，这里结合的TF跟激活物质相互作用，随后募集RNA聚合酶，启动转录的过程。[2]

实际细胞中的转录过程[3]:

Chip的目的

Chip是目前最佳的研究体内活细胞内DNA-TF相互作用的方法。它的基本步骤是：在活细胞状态下使用甲醛让蛋白质-DNA复合物发生交联（crosslink），固定住蛋白质-DNA复合物，随后裂解细胞、分离染色质，然后通过酶切（微球菌核酸酶）或者超声【现阶段用的比较少的切断方法】随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后选择特异的抗体，采用抗原-抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异的富集目的蛋白质结合的DNA片段，再通过反交联（reverse crosslink）释放结合蛋白的DNA片段，通过对目的片段的纯化和检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。